У більшості хворих антитіла до ВІЛ виявляються через 6–12 тижня після зараження з використанням тест-систем перших поколінь і через 3–4 тижні з використанням тест-систем третього покоління, що працюють за принципом сендвіч-ІФА з двома антигенами. Проте ВІЛ-інфекція виявляється вже через 2 тижні після зараження шляхом аналізу на антиген p24 і вже через 1 тиждень — шляхом аналізу на вірусну РНК.
Іншими словами, період вікна можна скоротити до 2 тижнів і більше за допомогою комплексного діагностичного підходу. Капсидний антиген p24 з'являється в крові при бурхливій реплікації вірусу в гострій гарячковій фазі ВІЛ-інфекції і в цей період легко виявляється за допомогою простого і порівняно дешевого ІФА. Якщо постає завдання виявити всіх ВІЛ-інфікованих, у тому числі осіб з ранніми стадіями інфекції, то необхідно використовувати весь арсенал аналізів: на антитіла, на антигени і на РНК. Проте тестування на вірусну РНК дорого стоять, що вимагає великих трудовитрат і нажаль недоступно для більшості лабораторій. Та все ж ті лабораторії, в яких є устаткування для ІФА, здатні виявляти більшість випадків ВІЛ-інфекції за умови тестування проб як на антитіла до ВІЛ, так і на антиген p24. В кінці 1990-х рр. з'явилися тест-системи для паралельного ІФА на антитіла до ВІЛ і антиген p24, що зняли необхідність проведення роздільних аналізів. Розроблено і впроваджується нове покоління комбінованих тест-систем для одночасного виявлення антитіл до ВІЛ і антигенів ВІЛ. Перевага комбінованих аналізів полягає в тому, що вони займають менше часу, вимагають менших трудовитрат й економічно вигідніші, ніж роздільні аналізи. Комбіновані тест-системи володіють високою аналітичною чутливістю як за рахунок вживання сендвіч-ІФА з двома антигенами для виявлення антитіл до ВІЛ, так і за рахунок одночасного виявлення антигена p24. В даний час на ринку є 8 комбінованих тест-систем четвертого покоління, що пройшли клінічні випробування: VIDAS HIV DUO Ultra (bioMérieux; Марси-л’Етуаль, Франція); Enzymun-test-hiv-combi (Boehringer; Мангейм, Німеччина); Vironostika HIV Uni-form II Ag/ab (Organon Teknika; Бокстел, Нідерланди); AXSYM-HIV Ag/ab (Abbott Laboratories; Ебботт-парк, Ілінойс, США); Enzygnost HIV Integral (Dade Behring; Марбург, Німеччина); Genescreen Plus HIV AG-AB (Bio-rad), and COBAS Core HIV Combi (Roche Diagnostics; Мангейм, Німеччина); ELECSYS-HIV Combi (Boehringer; Мангейм, Німеччина). У останній тест-системі застосований електрохемілюмінесцентний сендвіч-метод з двома антигенами; аналіз займає 18 хвилин; специфічність за даними випробувань на госпіталізованих хворих складає 99,8%. Ця тест-система дозволяє діагностувати ВІЛ-інфекцію на 5 днів раніше, ніж найчутливіші тест-системи на антитіла до ВІЛ. Існує ще одна комбінована тест-система без торгівельної марки для ІФА на антитіла і антиген p24 з чутливістю всього 99,5% і специфічністю 94,8%. Комбінований аналіз на антитіла і антиген для виявлення недавньої і тривало існуючої ВІЛ-інфекції виправданий не лише при тестуванні донорів крові, але і в багатьох клінічних ситуаціях. Ранній діагноз ВІЛ-інфекції шляхом виявлення антигена p24 дозволяє невідкладно почати лікування, провести консультування хворого й прийняти заходи для зниження ризику передачі інфекції. Завдяки здатності виявляти антиген p24 тест-системи четвертого покоління дозволяють діагностувати ВІЛ-інфекцію на ранніх стадіях. Ці тест-системи вельми корисні для діагностики недавньої й тривало існуючої ВІЛ-інфекції в лікарняних і незалежних клінічних лабораторіях й діагностичних центрах (як бюджетних, так і комерційних). До подібних установ нерідко звертаються пацієнти, ризик ВІЛ-інфекції в яких значно вищий, ніж у донорів крові. Для раннього виявлення ВІЛ-інфекції у таких пацієнтів потрібні тест-системи з високою аналітичною чутливістю. Поважно відзначити, що висока аналітична і епідеміологічна чутливість більшості тест-систем четвертого покоління, доведена у випробуваннях на хворих з різних популяцій, хворих з сероконверсією й хворих з різними підтипами ВІЛ, робить ці тест-системи незамінними для діагнозу як недавньої, так і тривало існуючої ВІЛ-інфекції в самих різних ситуаціях. Так, наприклад, в клінічних лабораторіях бюджетних установ охорони здоров'я тестування крові на антигени ВІЛ зазвичай не проводиться (це прерогатива станцій переливання крові), й тому при стандартному тестуванні на антитіла до ВІЛ випадки недавньої інфекції можуть бути пропущені. Було показано, що виявлення інфекції на ранніх стадіях дає підставу вчасно почати антиретровірусну терапію, що підвищує її ефективність. Крім того, з'являється можливість своєчасно проконсультувати пацієнта, правильно організувати його ведення і запобігти передачі ВІЛ-інфекції. Експрес-тести: Це клас тест-систем, що дають результат швидше, ніж через 30 хвилин. Експрес-тести для виявлення специфічних антитіл до ВІЛ з'явилися в кінці 1980-х рр., а на початку 1990-х рр. придбали популярність. Завдяки удосконаленню технології виробництва експрес-тести стали не менш точними, чим ІФА (за умови, що аналіз проводиться акуратно, кваліфікованим співробітником). Проте із-за уявної простоти експрес-тестів персонал часто допускає помилки. Наприклад, при внесенні реагентів піпетки не завжди тримають вертикально (як вказано в інструкції), що порушує співвідношення об'ємів реагентів. Ще одне джерело помилок — прагнення багатьох лаборантів одночасно провести аналіз декількох проб. Через це не витримується час етапів аналізу. При правильному виконанні експрес-тести на антитіла до ВІЛ дають надійні результати і можуть використовуватися в самих різних медичних установах й клінічних ситуаціях. Зокрема, їх застосовують в приймальних відділеннях, кабінетах лікарів, амбулаторіях, патологоанатомічних відділеннях, моргах, пунктах переливання крові, а також скрізь, де потрібне термінове тестування на ВІЛ (наприклад, після контакту медичного працівника з можливим джерелом інфекції). Експрес-тести на ВІЛ незамінні для тестування вагітних на пізніх строках вагітності, за якими не проводилося допологове спостереження (тобто вагітні з невиясненим ВІЛ-статусом). Показано, що антиретровірусна терапія (зокрема, зідовудіном) ефективно знижує ризик вертикальної передачі ВІЛ і що таке лікування в максимально ранні терміни необхідне матері, а потім й новонародженому. Експрес-тестування вагітної на ВІЛ в передпологовому періоді дозволяє в разі виявлення антитіл почати лікування до пологів. Поважно відзначити, що експрес-тести нескладні й можуть застосовуватися в країнах, що розвиваються, де лабораторії майже завжди погано обладнані, їх персонал недостатньо виучений, а в подачі електроенергії трапляються перебої. В одному з видів експрес-тестів використовується іммуноблоттінг (дот-блоттінг). Якщо проба містить антитіла до ВІЛ, то в кінці аналізу на твердій підкладці з'являється чітко обкреслена забарвлена крапка. Більшість сучасних тест-систем включають внутрішній контроль, який показує, що аналіз був проведений без помилок. Таким контролем є антитіла проти людських імуноглобулінів. Ці антитіла зв'язуються з будь-якими антитілами в пробі і, якщо всі реагенти були додані правильно, дають ще одну забарвлену крапку. Деякі експрес-тести дозволяють диференціювати антитіла до ВІЛ-1 і ВІЛ-2 (у таких тест-системах є 2 зони для нанесення реагентів і в результаті аналізу забарвлюється одна з двох можливих крапок). Всі експрес-тести, що працюють за принципом іммуноблоттінга, методично однакові й включають покраплинне додавання реагентів в наступній послідовності: буферний розчин, проба, промивальний буферний розчин, кон'югат, промивальний буферний розчин, хромогенний субстрат, стопи-реагент. У деяких експрес-тестах замість кон'югата використовують фарбувальний реагент — комплекс білка А із золотом. Білок А специфічно зв'язується з імуноглобулінами в пробі, а золото дає чорне фарбування. Таким чином вдається скоротити процедуру аналізу на одну операцію. Дуже зручні новітні однокрокові експрес-тести на антитіла до ВІЛ, що працюють за принципом іммунохроматографії. Їх основний компонент — вузька хроматографічна пластинка (пластикова або паперова). На кінчик пластинки наносять пробу (цілісну кров, сироватку або слину). Проба дифундує уздовж пластинки, в яку в певній послідовності імпрегніровані необхідні реагенти (замість кон'югата часто використовують комплекс білка А із золотом). Якщо в пробі присутні антитіла до ВІЛ, в певній зоні пластинки утворюється забарвлена смужка. У деяких іммунохроматографічних експрес-тестах використовується принцип сендвіча з двома антигенами. Іммунохроматографічні експрес-тести дають результат менш ніж через 10 хвилин (а деякі навіть через 2 хвилини), не вимагають поетапного додавання багаточисельних реагентів і включають внутрішні контролі для оцінки якості аналізу. Деякі експрес-тести можна зберігати в широкому інтервалі температур (від 15 до 30°c), а транспортувати їх дуже легко. Наприклад, експрес-тест Determine фірми Abbott поставляється у вигляді блоків по 10 пластинок в кожному і, таким чином, пластинки для 100 аналізів можуть уміщатися в кишені. У цьому експрес-тесті на пластинку наноситься лише сироватка або плазма, а інші реагенти не потрібні. Можна використовувати і цілісну венозну або капілярну кров, але тоді потрібно заздалегідь нанести буферний розчин. Іммунохроматографічні експрес-тести на антитіла до ВІЛ набувають все більш велику популярність, оскільки вони методично нескладні, результати їх очевидні і для їх виконання не потрібні кваліфіковані лаборанти. Їх можна застосовувати вдома або в пересувних лабораторіях. Для цього досить навчити будь-якого медичного працівника що до забору крові з пальця. Експрес-аналіз капілярної крові на антитіла до ВІЛ може використовуватися на станціях переливання крові для обстеження донорів перед крововіддачею (замість того, щоб брати дозу крові й зберігати її до приходу результатів з центральної лабораторії). Є іммунохроматографічні експрес-тести, призначені для виявлення антитіл до ВІЛ в будь-якому біологічному матеріалі (цілісної крові з вени або з пальця, плазмі, сироватці, слині). Це дає можливість використовувати той біологічний матеріал, який доступний в конкретній ситуації. Інший різновид експрес-тестів — це погружні тест-смужки, на яких є зубці, покриті антигеном. Деякі тест-смужки дозволяють диференціювати антитіла до ВІЛ-1 і ВІЛ-2. Недоліки таких тестів: суб'єктивність інтерпретації результату; неможливість оцінки результату, якщо лаборант страждає дальтонізмом; вища вартість, ніж в ІФА. В даний час в США дозволено використовувати 4 типи експрес-тестів. Прості тести: Прості тести на антитіла до ВІЛ займають більше 30 хвилин, але не вимагають лабораторного устаткування. Всі прості тести засновані на реакції аглютинації. Частки, покриті антигенами ВІЛ (еритроцити, частки латексу або желатину) інкубують з сироваткою. Якщо в сироватці присутні антитіла до ВІЛ, відбувається аглютинація і утворюються видимі конгломерати. Якщо використовуються еритроцити, методику називають пасивною гемагглютінацією, якщо використовуються частки латексу — латексом-аглютинацією. У країнах Далекого Сходу в простих тестах найчастіше використовують частки желатину. Такі тести дешеві, нескладні, досить чутливі й включають внутрішній контроль для виявлення неспецифічного скріплення сироваткових імуноглобулінів з желатином. Результати виходять через 2 години з мінімальними трудовитратами. Обов'язкова умова для проведення простих тестів — це наявність термостату (реакція аглютинації повинна проходити при певній постійній температурі). Підтверджуючі тести: Для підтвердження позитивного результату, отриманого при скринінговому тестуванні, необхідні високоспецифічні методики: іммуноблоттінг, непряма імунофлюоресценція або радіоімунопреципітація. При акуратному виконанні підтверджуючі тести не повинні давати псевдопозитивних результатів. Підтверджуючі методи більш дорогі та трудомісткі, чим скринінгові. В США підтверджуючі тести не повинні в обов'язковому порядку сертифікуватися Управлінням по контролю якості харчових продуктів й лікарських засобів. Виняток становлять підтверджуючі тести, які застосовуються для перевірки донорів крові з позитивною реакцією при скринінговому тестуванні (для повторного допуску до кровозабору результати підтверджуючого тесту мають бути негативними). Головне завдання підтверджуючих тестів — це виключення діагнозу ВІЛ-інфекції в осіб, не інфікованих ВІЛ, але що дали позитивну реакцію при скринінговому тестуванні. Іммуноблотінг: Іммуноблоттінг — найпоширеніший підтверджуючий тест для виявлення антитіл до ретровірусів; більшість фахівців вважають цей метод еталонним при підтвердженні ВІЛ-інфекції. Метод заснований на електрофоретичному розділенні антигенів ВІЛ, отриманих з лізата вірусів, вирощених в клітинній культурі. При електрофорезі вірусні білки денатуруються, набувають негативного заряду й розділяються по молекулярній масі. Розділення вірусних антигенів дозволяє виявляти специфічні антитіла до кожного з них в ході подальшого аналізу, методологічно схожого з ІФА. Суміш очищених антигенів ВІЛ вносять до декількох лунок на краю пластини поліакріламідного гелю, додецилсульфат натрію, що міститься, після чого проводять електрофорез. При цьому антигени ВІЛ з кожної лунки мігрують уздовж пластини гелю. Швидкість міграції визначається зарядом й молекулярною масою антигенів (так, високомолекулярні антигени проходять меншу відстань від точки старту). Після завершення електрофорезу гель накладають на мембрану нітроцелюлози й переносять на неї щоб розділилися антигени (ця процедура називається блоттінгом й проводиться шляхом електропереносу). Мембрану розрізають на смужки, на кожній з яких представлений повний набір антигенів ВІЛ. На смужки наносять тестовану або контрольну сироватку в розведенні 1:50 або 1:100, інкубують і відмивають. З цієї миті методика схожа з будь-яким непрямим імунним аналізом. Смужки інкубують з міченими антитілами проти людських імуноглобулінів. Як мітка зазвичай використовують фермент (пероксидазу або лужну фосфатазу), який каталізує перетворення безбарвного хромогенного субстрата в у забарвлений нерозчинний продукт. В результаті на смужці утворюються поперечні забарвлені смуги в тих місцях, де утворилися комплекси антиген-антитіло. Позитивні сироватки дають набір смуг, характерних для ВІЛ-інфекції. Багато з цих смуг були ідентифіковані як специфічні продукти вірусних генів. Антигени ВІЛ-1 при електрофорезі розподіляються таким чином (починаючи від точки старту): gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17, p15 (мал. 1). Буквою «p» позначають білки, буквами «gp» — глікопротеїди. Цифрами позначають молекулярну масу антигенів (у кДа). При аналізі результатів іммуноблоттінга треба пам'ятати, що у вихідному лізаті містяться не лише антигени ВІЛ, але й білки культивованих кліток, в яких розмножувався вірус. Ці білки можуть утворювати смуги в різних місцях, найчастіше — в зоні між 40 і 60 кДа. Неспецифічне скріплення антитіл з тестованої проби з клітинними білками може утруднити оцінку результатів. Інтерпретація результатів: Залежно від того, які антитіла до ВІЛ присутні в тестованій пробі, на смужках нітроцелюлози видно різні набори смуг. По характеристиці набору смуг (їх числу й інтенсивності фарбування) і судять про те, чи присутні в пробі антитіла до ВІЛ. Результати іммуноблоттінгу оцінюють по певних критеріях. Згідно з цими критеріями, проба вважається позитивною, якщо присутні принаймні дві з трьох смуг, відповідних антигенам p24, gp41 і gp120/160. Проба вважається негативною лише у тому випадку, коли немає жодної із смуг, відповідних антигенам ВІЛ. Проте дві організації, включаючи ВОЗ, дотримуються думки, що пробу можна вважати негативною, якщо є лише одна дуже слабо забарвлена смуга p17. Результат вважається сумнівним, якщо є одна смуга або більш, відповідна антигенам ВІЛ, але критерії позитивного результату не виконуються. На жаль, сироватки деяких людей, не інфікованих ВІЛ, при іммуноблоттінгу в тій або іншій мірі реагують з одним або декількома антигенами ВІЛ. Така реакція буває майже у 15% здорових людей, не інфікованих ВІЛ; вона нерідко спостерігається в осіб з негативним результатом скринінгового тестування. Таким чином, багато сироваток, що дали негативний результат при скринінговому тестуванні методом ІФА, дадуть сумнівний результат при іммуноблоттінгу. В більшості випадків при сумнівних результатах слабо забарвлюються смуги, відповідні білкам поліпротєїна Gag (головним чином, p17, p24 і p55). Зустрічаються і інші набори смуг, але рідше. Будь-який результат іммуноблоттінгу, що не задовольняє критеріям позитивного або негативного результату, повинен вважатися сумнівним.