Тест-системы четвёртого поколения для одновременного выявления антигенов ВИЧ и антител к ВИЧ

Другими словами, период окна можно сократить до 2 недель и более с помощью комплексного диагностического подхода. Капсидный антиген p24 появляется в крови при бурной репликации вируса в острой лихорадочной фазе ВИЧ-инфекции и в этот период легко обнаруживается с помощью простого и сравнительно дешевого ИФА. Если стоит задача выявить всех ВИЧ-инфицированных, в том числе лиц с ранними стадиями инфекции, то необходимо использовать весь арсенал анализов: на антитела, на антигены и на РНК. Однако тестирование на вирусную РНК дорого стоит, требует больших трудозатрат и недоступно для большинства лабораторий. И все же те лаборатории, в которых есть оборудование для ИФА, способны выявлять большинство случаев ВИЧ-инфекции при условии тестирования проб как на антитела к ВИЧ, так и на антиген p24. В конце 1990-х гг. появились тест-системы для параллельного ИФА на антитела к ВИЧ и антиген p24, снявшие необходимость проведения раздельных анализов. Разработано и внедряется новое поколение комбинированных тест-систем для одновременного выявления антител к ВИЧ и антигенов ВИЧ. Преимущество комбинированных анализов заключается в том, что они занимают меньше времени, требуют меньших трудозатрат и экономически более выгодны, чем раздельные анализы. Комбинированные тест-системы обладают высокой аналитической чувствительностью как за счет применения сэндвич-ИФА с двумя антигенами для выявления антител к ВИЧ, так и за счет одновременного выявления антигена p24. В настоящее время на рынке имеется 8 комбинированных тест-систем четвертого поколения, прошедших клинические испытания: VIDAS HIV DUO Ultra (bioMérieux; Марси-л’Этуаль, Франция); Enzymun-Test-HIV-Combi (Boehringer; Мангейм, Германия); Vironostika HIV Uni-Form II Ag/AB (Organon Teknika; Бокстел, Нидерланды); AxSYM-HIV Ag/AB (Abbott Laboratories; Эбботт-Парк, Иллинойс, США); Enzygnost HIV Integral (Dade Behring; Марбург, Германия); Genescreen Plus HIV Ag-AB (Bio-Rad), and COBAS Core HIV Combi (Roche Diagnostics; Мангейм, Германия); Elecsys-HIV Combi (Boehringer; Мангейм, Германия). В последней тест-системе применен электрохемилюминесцентный сэндвич-метод с двумя антигенами; анализ занимает 18 минут; специфичность по данным испытаний на госпитализированных больных составляет 99,8%. Эта тест-система позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию на 5 дней раньше, чем самые чувствительные тест-системы на антитела к ВИЧ. Существует еще одна комбинированная тест-система без торговой марки для ИФА на антитела и антиген p24 с чувствительностью всего 99,5% и специфичностью 94,8%. Комбинированный анализ на антитела и антиген для выявления недавней и длительно существующей ВИЧ-инфекции оправдан не только при тестировании доноров крови, но и во многих клинических ситуациях. Ранний диагноз ВИЧ-инфекции путем выявления антигена p24 позволяет безотлагательно начать лечение, провести консультирование больного и принять меры для снижения риска передачи инфекции. Благодаря способности выявлять антиген p24 тест-системы четвертого поколения позволяют диагностировать ВИЧ-инфекцию на ранних стадиях. Эти тест-системы весьма полезны для диагностики недавней и длительно существующей ВИЧ-инфекции в больничных и независимых клинических лабораториях и диагностических центрах (как бюджетных, так и коммерческих). В подобные учреждения нередко обращаются пациенты, риск ВИЧ-инфекции у которых значительно выше, чем у доноров крови. Для раннего выявления ВИЧ-инфекции у таких пациентов требуются тест-системы с высокой аналитической чувствительностью. Важно отметить, что высокая аналитическая и эпидемиологическая чувствительность большинства тест-систем четвертого поколения, доказанная в испытаниях на больных из разных популяций, больных с сероконверсией и больных с разными подтипами ВИЧ, делает эти тест-системы незаменимыми для диагноза как недавней, так и длительно существующей ВИЧ-инфекции в самых разных ситуациях. Так, например, в клинических лабораториях бюджетных учреждений здравоохранения тестирование крови на антигены ВИЧ обычно не проводится (это прерогатива станций переливания крови), и поэтому при стандартном тестировании на антитела к ВИЧ случаи недавней инфекции могут быть пропущены. Было показано, что выявление инфекции на ранних стадиях дает основание вовремя начать антиретровирусную терапию, что повышает ее эффективность. Кроме того, появляется возможность своевременно проконсультировать пациента, правильно организовать его ведение и предотвратить передачу ВИЧ-инфекции. Экспресс-тесты: Это класс тест-систем, дающих результат быстрее, чем через 30 минут. Экспресс-тесты для выявления специфических антител к ВИЧ появились в конце 1980-х гг., а в начале 1990-х гг. приобрели популярность. Благодаря усовершенствованию технологии производства экспресс-тесты стали не менее точными, чем ИФА (при условии, что анализ проводится аккуратно, квалифицированным сотрудником). Однако из-за мнимой простоты экспресс-тестов персонал часто допускает ошибки. Например, при внесении реагентов пипетки не всегда держат вертикально (как указано в инструкции), что нарушает соотношение объемов реагентов. Еще один источник ошибок — стремление многих лаборантов одновременно провести анализ нескольких проб. Из-за этого не выдерживается время этапов анализа. При правильном выполнении экспресс-тесты на антитела к ВИЧ дают надежные результаты и могут использоваться в самых разных медицинских учреждениях и клинических ситуациях. В частности, их применяют в приемных отделениях, кабинетах врачей, амбулаториях, патологоанатомических отделениях, моргах, пунктах переливания крови, а также везде, где требуется срочное тестирование на ВИЧ (например, после контакта медицинского работника с возможным источником инфекции). Экспресс-тесты на ВИЧ незаменимы для тестирования рожениц, за которыми не проводилось дородовое наблюдение (т. е. рожениц с невыясненным ВИЧ-статусом). Показано, что антиретровирусная терапия (в частности, зидовудином) эффективно снижает риск вертикальной передачи ВИЧ и что такое лечение в максимально ранние сроки необходимо матери, а затем и новорожденному. Экспресс-тестирование беременной на ВИЧ в предродовом периоде позволяет в случае выявления антител начать лечение до родов. Важно отметить, что экспресс-тесты несложны и могут применяться в развивающихся странах, где лаборатории почти всегда плохо оборудованы, их персонал недостаточно обучен, а в подаче электроэнергии случаются перебои. В одном из видов экспресс-тестов используется иммуноблоттинг (дот-блоттинг). Если проба содержит антитела к ВИЧ, то в конце анализа на твердой подложке появляется четко очерченная окрашенная точка. Большинство современных тест-систем включают внутренний контроль, который показывает, что анализ был проведен без ошибок. Таким контролем являются антитела против человеческих иммуноглобулинов. Эти антитела связываются с любыми антителами в пробе и, если все реагенты были добавлены правильно, дают еще одну окрашенную точку. Некоторые экспресс-тесты позволяют дифференцировать антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (в таких тест-системах имеются 2 зоны для нанесения реагентов и в результате анализа окрашивается одна из двух возможных точек). Все экспресс-тесты, работающие по принципу иммуноблоттинга, методически одинаковы и включают покапельное добавление реагентов в следующей последовательности: буферный раствор, проба, промывочный буферный раствор, конъюгат, промывочный буферный раствор, хромогенный субстрат, стоп-реагент. В некоторых экспресс-тестах вместо конъюгата используют красящий реагент — комплекс белка А с золотом. Белок А специфически связывается с иммуноглобулинами в пробе, а золото дает черное окрашивание. Таким образом удается сократить процедуру анализа на одну операцию. Очень удобны новейшие одношаговые экспресс-тесты на антитела к ВИЧ, работающие по принципу иммунохроматографии. Их основной компонент — узкая хроматографическая пластинка (пластиковая или бумажная). На кончик пластинки наносят пробу (цельную кровь, сыворотку или слюну). Проба диффундирует вдоль пластинки, в которую в определенной последовательности импрегнированы необходимые реагенты (вместо конъюгата часто используют комплекс белка А с золотом). Если в пробе присутствуют антитела к ВИЧ, в определенной зоне пластинки образуется окрашенная полоска. В некоторых иммунохроматографических экспресс-тестах используется принцип сэндвича с двумя антигенами. Иммунохроматографические экспресс-тесты дают результат менее чем через 10 минут (а некоторые даже через 2 минуты), не требуют поэтапного добавления многочисленных реагентов и включают внутренние контроли для оценки качества анализа. Некоторые экспресс-тесты можно хранить в широком интервале температур (от 15 до 30°C), а транспортировать их очень легко. Например, экспресс-тест Determine фирмы Abbott поставляется в виде блоков по 10 пластинок в каждом и, таким образом, пластинки для 100 анализов могут уместиться в кармане. В этом экспресс-тесте на пластинку наносится только сыворотка или плазма, а другие реагенты не нужны. Можно использовать и цельную венозную или капиллярную кровь, но тогда требуется предварительно нанести буферный раствор. Иммунохроматографические экспресс-тесты на антитела к ВИЧ приобретают все большую популярность, поскольку они методически несложны, результаты их очевидны и для их выполнения не нужны квалифицированные лаборанты. Их можно применять на дому или в передвижных лабораториях. Для этого достаточно обучить любого медицинского работника взятию крови из пальца. Экспресс-анализ капиллярной крови на антитела к ВИЧ может использоваться на станциях переливания крови для обследования доноров перед кроводачей (вместо того, чтобы брать дозу крови и хранить ее до прихода результатов из центральной лаборатории). Имеются иммунохроматографические экспресс-тесты, предназначенные для выявления антител к ВИЧ в любом биологическом материале (цельной крови из вены или из пальца, плазме, сыворотке, слюне). Это дает возможность использовать тот биологический материал, который доступен в конкретной ситуации. Другая разновидность экспресс-тестов — это погружные тест-полоски, на которых имеются зубцы, покрытые антигеном. Некоторые тест-полоски позволяют дифференцировать антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Недостатки таких тестов: субъективность интерпретации результата; невозможность оценки результата, если лаборант страдает дальтонизмом; более высокая стоимость, чем у ИФА. В настоящее время в США разрешено использовать 4 типа экспресс-тестов. Простые тесты: Простые тесты на антитела к ВИЧ занимают более 30 минут, но не требуют лабораторного оборудования. Все простые тесты основаны на реакции агглютинации. Частицы, покрытые антигенами ВИЧ (эритроциты, частицы латекса или желатина) инкубируют с сывороткой. Если в сыворотке присутствуют антитела к ВИЧ, происходит агглютинация и образуются видимые конгломераты. Если используются эритроциты, методику называют пассивной гемагглютинацией, если используются частицы латекса — латекс-агглютинацией. В странах Дальнего Востока в простых тестах чаще всего используют частицы желатина. Такие тесты дешевы, несложны, достаточно чувствительны и включают внутренний контроль для выявления неспецифического связывания сывороточных иммуноглобулинов с желатином. Результаты получаются через 2 часа с минимальными трудозатратами. Обязательное условие для проведения простых тестов — это наличие термостата (реакция агглютинации должна проходить при определенной постоянной температуре). Подтверждающие тесты: Для подтверждения положительного результата, полученного при скрининговом тестировании, необходимы высокоспецифичные методики: иммуноблоттинг, непрямая иммунофлюоресценция или радиоиммунопреципитация. При аккуратном выполнении подтверждающие тесты не должны давать ложноположительных результатов. Подтверждающие методы более дороги и трудоемки, чем скрининговые. В США подтверждающие тесты не должны в обязательном порядке сертифицироваться Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств. Исключение составляют подтверждающие тесты, которые применяются для проверки доноров крови с положительной реакцией при скрининговом тестировании (для повторного допуска к кроводаче результаты подтверждающего теста должны быть отрицательными). Главная задача подтверждающих тестов — это исключение диагноза ВИЧ-инфекции у лиц, не инфицированных ВИЧ, но давших положительную реакцию при скрининговом тестировании. Иммуноблотинг: Иммуноблоттинг — самый распространенный подтверждающий тест для выявления антител к ретровирусам; большинство специалистов считают этот метод эталонным при подтверждении ВИЧ-инфекции. Метод основан на электрофоретическом разделении антигенов ВИЧ, полученных из лизата вирусов, выращенных в клеточной культуре. При электрофорезе вирусные белки денатурируются, приобретают отрицательный заряд и разделяются по молекулярной массе. Разделение вирусных антигенов позволяет выявлять специфические антитела к каждому из них в ходе последующего анализа, методологически сходного с ИФА. Смесь очищенных антигенов ВИЧ вносят в несколько лунок на краю пластины полиакриламидного геля, содержащего додецилсульфат натрия, после чего проводят электрофорез. При этом антигены ВИЧ из каждой лунки мигрируют вдоль пластины геля. Скорость миграции определяется зарядом и молекулярной массой антигенов (так, высокомолекулярные антигены проходят меньшее расстояние от точки старта). После завершения электрофореза гель накладывают на нитроцеллюлозную мембрану и переносят на нее разделившиеся антигены (эта процедура называется блоттингом и проводится путем электропереноса). Мембрану разрезают на полоски, на каждой из которых представлен полный набор антигенов ВИЧ. На полоски наносят тестируемую или контрольную сыворотку в разведении 1:50 или 1:100, инкубируют и отмывают. С этого момента методика сходна с любым непрямым иммунным анализом. Полоски инкубируют с мечеными антителами против человеческих иммуноглобулинов. В качестве метки обычно используют фермент (пероксидазу или щелочную фосфатазу), который катализирует превращение бесцветного хромогенного субстрата в окрашенный нерастворимый продукт. В результате на полоске образуются поперечные окрашенные полосы в тех местах, где образовались комплексы антиген-антитело. Положительные сыворотки дают набор полос, характерный для ВИЧ-инфекции. Многие из этих полос были идентифицированы как специфические продукты вирусных генов. Антигены ВИЧ-1 при электрофорезе распределяются следующим образом (начиная от точки старта): gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17, p15 (рис. 1). Буквой «p» обозначают белки, буквами «gp» — гликопротеиды. Цифрами обозначают молекулярную массу антигенов (в кДа). При анализе результатов иммуноблоттинга надо помнить, что в исходном лизате содержатся не только антигены ВИЧ, но и белки культивируемых клеток, в которых размножался вирус. Эти белки могут образовывать полосы в разных местах, чаще всего — в зоне между 40 и 60 кДа. Неспецифическое связывание антител из тестируемой пробы с клеточными белками может затруднить оценку результатов. Интерпретация результатов: В зависимости от того, какие антитела к ВИЧ присутствуют в тестируемой пробе, на нитроцеллюлозных полосках видны разные наборы полос. По характеристике набора полос (их числу и интенсивности окрашивания) и судят о том, присутствуют ли в пробе антитела к ВИЧ. Результаты иммуноблоттинга оценивают по определенным критериям. Согласно этим критериям, проба считается положительной, если присутствуют по крайней мере две из трех полос, соответствующих антигенам p24, gp41 и gp120/160. Проба считается отрицательной только в том случае, когда нет ни одной из полос, соответствующих антигенам ВИЧ. Однако две организации, включая ВОЗ, придерживаются мнения, что пробу можно считать отрицательной, если имеется лишь одна очень слабо окрашенная полоса p17. Результат считается сомнительным, если имеется одна полоса или более, соответствующая антигенам ВИЧ, но критерии положительного результата не выполняются. К сожалению, сыворотки некоторых людей, не инфицированных ВИЧ, при иммуноблоттинге в той или иной степени реагируют с одним или несколькими антигенами ВИЧ. Такая реакция бывает почти у 15% здоровых людей, не инфицированных ВИЧ; она нередко наблюдается у лиц с отрицательным результатом скринингового тестирования. Таким образом, многие сыворотки, давшие отрицательный результат при скрининговом тестировании методом ИФА, дадут сомнительный результат при иммуноблоттинге. В большинстве случаев при сомнительных результатах слабо окрашиваются полосы, соответствующие белкам полипротеина Gag (главным образом, p17, p24 и/или p55). Встречаются и другие наборы полос, но реже. Любой результат иммуноблоттинга, не удовлетворяющий критериям положительного или отрицательного результата, должен считаться сомнительным.